RNA研究“高级”实验原理及操作介绍

  培养的细胞在活细胞中交联,它们的染色质被提取并均匀化。利用磁性链霉亲和素珠,将感兴趣的RNA与目标RNA杂交并分离得到生物素化互补寡核苷酸。将纯化的染色质洗脱成蛋白质、RNA或DNA,然后进行下游检测以进行鉴定和定量,ChIRP-Seq能在全基因组水平上对lncRNA与染色质之间所有潜在的相互作用位点进行标记。

  原理:戊二醛固定细胞后,利用声波降解法进行细胞裂解和染色质断裂,在裂解物中加入带生物素标记的oligo探针与lncRNA杂交,利用链霉素亲和磁珠分离纯化(与生物素亲和)。最后加RNaseA,从复合物中将lncRNA结合的蛋白和DNA片段洗脱下来,用于后续分析。

  RNA原位杂交(RNA in situ hybridization):在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的RNA核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相杂交,精准二码免费公开二肖二码中特经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA/lncRNA等分子,可检测该lncRNA是否位于核内或在细胞内的分布情况。

  原理:将特定标记的已知序列核酸做为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交,从而对特定核酸进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。根据RNA序列设计cDNA探针,可结合RNA和DNA。

  FISH:对于RNA分布定位,一般会使用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)。该技术利用荧光探针,根据碱基互补的原则, 在细胞或组织内与靶lncRNA杂交,再利用激光共聚焦显微镜等检测手段,通过荧光分布及强度判断lncRNA分子分布状态。验证其亚细胞定位,从而推测lncRNA的调控机制。

  原理:用已知的标记单链为探针,与材料中未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被检测的双链核酸。将核酸探针的某种核苷酸标记上报告分子,如地高辛,生物素。可利用该报告分子与荧光素标记的特异性亲和素之间的免疫化学反应,经过荧光检测体系在镜下对待测DNA或RNA进行定性,定量或相对定位分析。

  RACE:基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA,通过往两端延伸而获得完整的3’和5’端的方法。该方法可确定lnc RNA5’和3’末端序列,进而获得lncRNA的全长序列

  3’原理:利用RNA3’端PolyA尾做为引物结合点,利用Oligo(dt)作为引物反转录合成第一链cDNA,然后以一个基因特意引物GSP1作为上游引物,用一个通用引物UPM做下游引物,以cDNA第一链为模板,进行PCR扩增,吧目的基因3’端的DNA片段扩增出来。

  5’原理:利用Oligo(dt)结合3’端PolyA反转出第一链cDNA,利用反转录酶的末端转移酶的活性在第一链的5’端加上3-5个(dc)残基,退火后与Oligo(dg)通用引物,一第一链为模板延伸并接上通用接头。然后用通用引物UPM为上游,特意基因引物GSP2为下游以第一链为模板进行PCR扩增,把目的基因5’端cDNA片段扩增出来。

  Self-ligation原理:用5’端磷酸化RT Primer反转录,用RNA酶将RNA分解,用RNA ligase进行环化或形成首尾连接物,PCR扩增5’端未知区域,胶回收后DNA序列测定。

  Northern blot:将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。通过检测RNA的表达水平来检测基因表达。

  原理:根据分子量大小不同将不同的RNA分离开来,将其原位转移至固相支持物上,再用标记过的DNA或RNA为探针,依据碱基互补配对原则进行杂交,最后进行显影或显色。以目标RNA所在位置,显影强度可指示目标RNA在所测样品中的相对含量。

  荧光素酶报告系统:在荧光素酶报告基因载体的报告基因编码区下游插入lncRNA结合序列或者mRNA 3’UTR区,然后将载体转染细胞并改变细胞中miRNA的表达水平,通过检测荧光素酶的表达情况以分析lnc RNA或mRNA的3’UTR区中是否含有miRNA的靶点。

  CLIP-Seq:也称为HITS-CLIP,是将紫外交联免疫共沉淀技术与高通量测序技术相结合,在全基因组水平上揭示RNA分子与RNA结合蛋白相互作用的技术。

  原理:在紫外照射下将细胞内RNA分子与RNA结合蛋白进行偶联,细胞裂解,通过免疫沉淀将RNA与蛋白质复合体沉淀,核酸酶将共沉淀RNA切割,只保留蛋白质内部的RNA片段。通过5’端放射性标记分子及SDS-PAGE电泳,选择性回收蛋白结合的RNA片段,最后进行高通量测序。

  RNA蛋白免疫沉促使细胞内RNA,蛋白质之间交联,形成RNA-Protein复合物。之后用特异性抗体免疫沉淀复合物,与蛋白质结合的RNA即可被分离,纯化。之后对分离的RNA进行PT-PCR,RIP-Chip或高通量测序(RIP-Seq)分析。

  凝胶迁移或电泳迁移实验,是一种研究DNA-蛋白质或RNA-蛋白质相互作用的技术。

  原理:将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。RNA复合物比非结合的探针移动的慢。该实验是将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。如果蛋白质可以跟DNA或RNA结合,它的泳动速度就会比非结合的DNA或RNA探针慢。

  使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白质复合物,该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过WB或MS来检测。